编者按：控制实验是非常专业的反应机理验证的技术。笔者仅仅学了些皮毛，大部分知识来自于文献阅读。笔者只能用不甚严谨的语言，描述自己的观点。内容必有疏漏，请各位读者批评指正。

内容摘要：

一、氘代标记实验

二、动力学同位素效应（KIE）实验

三、原位核磁跟踪反应进程

四、中间体捕获实验

五、中间体在关键反应中的表现

六、催化物种浓度或ee值对反应的影响

七、严格且定量地控制反应条件

八、光介导反应的特殊实验

九、特殊底物的反应

十、DFT计算

正文部分：

一、氘代标记实验

氘代标记实验有两类。第一类是将底物中关键位置的H替换成D，看产物中是否存在氘代，哪里氘代，氘代率是多少。由此可以获得两个重要信息：从氘的位置倒推碳架的变动，氘代率判断反应中是否存在H/D交换，推测可能是哪个环节发生交换。上述信息可以有力地验证既有的机理推测，或为推测机理提供重要依据。要点：

① 氘代底物/原料的制备：氘代氢化锂铝（d₄-LAH/LiAlD₄）、氘代硼氢化钠（NaBD₄）和氰基硼氘化钠（NaBD₃CN）是最常用的氘代还原试剂。例如：氘代醛（CDO）可将酯用LiAlD₄还原/DMP氧化制得；苄基只氘代一个氢，可用(1-溴乙基)苯与LiAlD₄反应制得；两个苄氢都氘代可用苯乙酸钠与氘水（D₂O）交换后再还原等。其他特殊氘代产物的合成方法需要详细查阅文献确定，例如3-氘噻吩可从3-胺基噻吩出发，以d₈-THF作溶剂制得。当然也可以直接花钱买。

② 氘代原料的收谱：只收氢谱，不收碳谱。严格来说氘对H的耦合会产生裂分，但我接触的氘代化合物的谱图中，被氘代的H的峰直接消失（99% D）或显著变矮（≤90% D），其他峰几乎没有变化。

③ 氘代原料要严格保存，标识清晰，不能与非氘代原料混淆。

④ 氘代原料的关键反应，从粗核磁到过柱后的核磁都要做，而且与非氘代的产物谱图详细对照，确定氘在产物中的具体位置。原料和产物的氘代率更要仔细对比，消除匀场质量高低、积分范围多寡对积分值的影响等偶然因素。

⑤ 如果氘代率没有损失，一切好说。如果氘代率出现显著损失，例如原料99%D而产物50%D，需要设计新的实验以求证，至少要验证氘代率的降低与反应条件、试剂等有无关系。例如，我的课题是有机碱催化的反应，最佳条件下使用的碱会降低氘代率，其他碱就不会。因为其他碱的化学结构与最佳碱有显著区别，为我们确定机理提供了重要证据。

第二类氘代标记实验是不使用氘代原料，而将反应涉及的试剂、溶剂等逐个替换为氘代试剂/溶剂，看产物的氘代情况。如果氘代率高，说明产物的氢来自被替换的试剂/溶剂；如果在氘代溶剂中反应产物氘代率低，则用干燥的氘代溶剂+大过量的氘水反应，如果氘代率高则产物的氢来自溶剂中的水。

二、动力学同位素效应（KIE）实验

动力学同位素效应，指将原料中某个原子替换成它的稳定同位素，看关键反应的速率有无变化。如果反应速度变慢了，说明该原子所处的化学键在反应中起关键作用，即“该反应存在显著的动力学同位素效应”。

同位素效应实验可以将氢替换成氘，也可以将氧（¹⁶O）替换成 ¹⁸O或把碳（¹²C）替换成¹³C。由于只有氢和同位素D的质量相差最大（50%），而氧和碳差距小，所以KIE值差距十分明显。再加上多数时候只用一级动力学同位素效应（Primary KIE）研究机理，所以KIE实验几乎都把氢替换成氘。

如果“关键作用”指同位素原子所处的化学键的断裂与形成发生在反应的“决速步”（Rate-Determining Step）中，那么这是一级动力学同位素效应（Primary KIE），是最常用的机理研究策略。所谓“决速步”，即整个反应中的最慢一步。如果一级KIE值＞2.0时，则认为“具有显著KIE效应”。严格说来，如果发现KIE效应，C-H断裂可能是决速步。但如果没发现KIE效应，则C-H断裂一定不是决速步。

如果“关键作用”指同位素原子所处化学键没有断裂，但键可能变弱或导致相关原子状态变化，最终导致反应速率略有差异，那么这是二级动力学同位素效应（Secondary KIE）。例如氘代后，由于原子振动对C-D键影响比C-H小，能量障碍低，所以反应可能稍快。然而，二级KIE比一级KIE影响小得多，理论上一级KIE值 ≈ 6.5，二级KIE值只有0.71~0.41。

KIE实验有三种做法：① “一锅”分子间竞争实验（intermolecular competition）：氘代原料和非氘代原料各一半（例如各0.1 mmol），同时投入反应（总反应规模仍是标准的0.2 mmol），看哪个消耗得更快；② 分子内竞争实验（intramolecular competition）：原料内有两个反应位点，将其中一个替换为氘，投入反应后看哪个位点反应更容易；③ 平行实验（parallel experiment）：将氘代原料和非氘代原料分别投反应（例如开两个反应，规模均为0.2 mmol），各自测定反应速率。

但是，竞争实验与平行实验的结果有可能出现区别。例如，平行实验可能观察不到KIE效应，但竞争实验有；分子间竞争没有，但分子内竞争有（可能是D代后出现手性碳导致D/H不等价）。

KIE值的计算：kH/kD，即非氘代原料（正常原料）的反应速率常数与氘代原料的反应速率常数的比值。对于①和②来说，kH/kD为非氘代产物与氘代产物的比例，由核磁确定。由于①和②可以确保C–H键和C–D键的反应在相同反应条件下发生，因此二者相较于③具有更高的准确度。其中②的误差比①还小，但原料合成可能更复杂；①的氘代/非氘代原料可能相互影响；对于③来说，速率常数要在低转化率下（纵轴＜30%）通过产率（纵轴）与反应时间（横轴）的线性拟合算出，故虽然直接了当但反应条件必须高度一致。

三、原位核磁跟踪反应进程

例如，研究苯偶酰与亚磷酰胺生成Kukhtin-Ramirez 加合物的反应，需要用NMR跟踪反应。由于K-R加合物不稳定，与亚磷酰胺一样对水氧敏感，因此需要向杨氏核磁管（即阀门核磁管，无水无氧专用，是一个细长的封管）中放入苯偶酰并用油泵置换氩气三次，再送入手套箱；手套箱中还有用低温减压蒸馏法制备、与分子筛一同保存在溶剂存储瓶（Schlenk拧口管）中的超干CD₂Cl₂和分装的亚磷酰胺；在手套箱中拧开杨氏核磁管的旋塞，加入 CD₂Cl₂ 并用微量进样器加入亚磷酰胺，反应由此开始。

使用同一台核磁，在反应10分钟、20分钟、30分钟、50分钟、16小时分别扫¹H-NMR和³¹P-NMR ，在核磁老师的协助下上样（过于粗大必须手动上样）：10分钟时，¹H-NMR在7.28-7.00 ppm中出现三组新的信号峰，³¹P-NMR出现23.01 ppm和-9.13 ppm等两组主要信号峰，16小时后-9.13 ppm的信号峰消失，但-34.68 ppm的信号峰愈来愈强。

由此说明：① 加合物的生成非常迅速，10分钟基本结束；② 苯偶酰的K-R加合物可以在室温下稳定存在一段时间，久置仍会分解。

注意：① 你需要测得苯偶酰在CD₂Cl₂的¹H-NMR和亚磷酰胺在CD₂Cl₂中的³¹P-NMR，因为即使从SciFinder找到.jpg格式的谱图也找不到源文件，故无法用Mestrenova直观对比，而CDCl₃中测定的谱图因氘代溶剂不同，信号峰位移有差别而不能用于对比；② 杨氏核磁管很贵，使用前必须洗净、烘干，避免水分干扰；测试时既要小心无法弹出，也要小心弹出时磕碎顶部。

读者在实操中，应结合自身反应特点设计核磁跟踪实验。文献中也有¹¹B-NMR（10.1039/d5sc00190k; 10.1002/anie.202315232）和¹⁹F-NMR（10.1021/jacs.5c05035）的跟踪实验。

四、中间体捕获实验

① 自由基淬灭/探针实验：向反应体系中加入自由基捕获剂，如TEMPO、galvinoxy（加尔万氧基自由基）、BHT、苯醌、DPPH、硝基苯醌、四甲基苯醌、苯基-N-叔丁基硝酮等，如反应产物形成被显著抑制（产率暴跌）且检测到捕获物（核磁产率最好，HRMS测得也行）则反应存在自由基中间体；如果反应没有受到影响则反应不太可能由自由基路径进行。此外还可根据反应特质，加入1,1-二苯基乙烯、丙烯酸苄酯、二甲基富马酸酯或Hantzsch酯（HE）等非经典捕获剂，视其对反应的影响（使用HE观察到“氢化”产物等）。

② 自由基钟实验：使用环丙基取代的原料投入反应，看是否出现环丙烷开环的产物。如果出现，结合自由基捕获实验可确证确实存在自由基中间体（环丙基甲基自由基可以重排成烯丁基自由基）；如果环丙基在产物中完整保留，则不太可能存在自由基中间体。

③ 外加亲核试剂捕获碳正离子中间体，可以理解为特殊的底物拓展。

五、中间体在关键反应中的表现

用其他手段制得（多为查阅文献+分步合成）或从反应体系中分离出推测的中间体/催化物种，先用各种手段进行表征，再在标准条件下投入反应，观察反应能否照常发生。如果得不到产物，说明预期中间体不是真正中间体；如果能则看反应的（非）对映选择性和产率有无显著变化。如果没变化，说明实验结果支持了我们对反应中间体的推测。

如分离或制得的中间体/催化物种是有机小分子，表征手段包括氢谱、碳谱和高分辨质谱；如是金属配合物，则包括ICP-OES（电感耦合等离子体发射光谱仪）进行元素分析；Mossbauer光谱（穆斯堡尔谱）和XPS（X射线光电子能谱）研究核的价态和磁性质等。²⁷Al还可以打核磁。

反应体系的实时监测则有如下手段：① UV-Vis（紫外-可见光谱）研究反应体系中催化剂的电子状态；② ESR（电子自旋共振谱）和EPR（电子顺磁共振谱）可以判断反应体系中是否存在自由基；③ HRMS（高分辨质谱）检测是否存在关键中间体等；④ 核磁（见第三部分），可观察到中间体的信号。

例① 推测降蒈二烯是环丙烷在质子酸活化下扩环重排的中间体，于是用Lewis酸催化的氢芳基化反应/脱卤制得降蒈二烯，发现其在质子酸活化下反应，以优秀的产率得到一样的产物，说明降蒈二烯就是中间体。

例② 推测4-炔基-2,3-二氢呋喃是质子酸活化的串联Cloke-Wilson重排/水解的中间体，于是用富电子原料在Lewis酸催化下制得4-炔基-2,3-二氢呋喃，随后在质子酸催化下反应，以优秀的产率得到同样产物，推测得证。

六、催化物种浓度或ee值对反应的影响

例① 浓度依赖性研究（J. Am. Chem. Soc. 2025, 147, 28313–28321）：作者以环丙醇为原料，发现催化剂浓度与[环丙基产物与开环产物的比例]呈线性关系，说明催化剂浓度越高，自由基中间体越容易被捕获而不会引起环丙烷开环，证明了作者推测的“自由基逃逸机制”。10.1021/jacs.5c01228则发现反应速率与金属配合物、原料的浓度成正比（一级反应）；与另一原料和试剂的浓度无关（零级反应）。

例② 非线性效应研究（nonlinear effects study, J. Am. Chem. Soc. 2025, 147, 7282–7292; J. Am. Chem. Soc. 2025, 147, 25264–25272; 10.1002/anie.202506157）：作者使用不同ee值的手性配体进行反应，发现产物的ee值与配体的ee值呈线性关系，说明参与立体决定步骤的复合物中金属与配体是1:1配位（仅涉及一个手性中心）。

例③ 反应动力学研究（10.1002/anie.202509778）：作者测定不同反应时间下两种产物的产率并绘图，两者形成速度如有显著差别，则形成速度快的产物具有动力学优势。

七、严格且定量地控制反应条件

例① 完全遮光下（光开关实验）、不加催化剂、不同配体的钯的催化剂、不加碱、把溶剂换成别的类似结构的溶剂，能否生成产物。可以理解为特殊且重要的条件筛选。

例② 研究叔丁醇钾促进的去甲酰化反应，最初发现反应的非对映选择性波动很大。推测原因是久置的分装的叔丁醇钾吸潮，于是我们在严格除水的条件下反应（手套箱中叔丁醇钾+玻仪与磁子热风枪500℃现吹），并不断外加叔丁醇，观察反应结果。发现叔丁醇越多，构型保持产物越多；严格除水且无外加叔丁醇时，只有构型翻转的产物。

八、光介导反应的特殊实验

声明：以下内容是笔者读文献+查书积攒来的一点小知识。

① 光致发光/荧光淬灭实验（Stern-Volmer quenching experiment），可绘制激发态的光敏剂的I₀/I（不加淬灭剂的荧光强度与加了淬灭剂的荧光强度的比值）与某一反应物浓度的关系图，如果两者是线性关系，则该物质为淬灭剂。

② 循环伏安法（cyclic voltammetry experiment）绘制电流-电势曲线，测定各物质的氧化电位，判断是否可能出现单电子转移（电有机化学也需要该方法）。

③ 荧光量子产率（quantum yield of fluorescence）是光反应中光量子的利用率，量子产率＞1表示反应为链式反应，＜1表示反应为非链式反应。

九、特殊底物的反应

例① 在参与反应官能团彼此间“碳链距离”不变的情况下，将母环苯基替换成环己烯基、长链烷基会得到怎样的产物？大位阻的原料得到新的产物、中间体、不反应还是反应乱？在其他地方减小位阻或增大活性（换为更富电子的杂环）能不能得到目标产物？据此判断中间体形成等重要步骤对位阻的敏感程度。对电子效应的敏感度也可设计类似实验验证。

例② 分别使用两种构型的光学纯（手性）原料反应，产物是否消旋？

例③ 分子间交叉实验：两种不同取代的原料（乙酰基和对甲苯基，有不同化学环境下的甲基）各取0.1 mmol在标准条件下反应。看产物是各自对应的产物还是交叉产物，据此判断反应是否为协同过程。

十、DFT计算

密度泛函理论可以计算原料、产物、中间体和过渡态的能量搭建反应势能面，确定反应能垒，据此优化过渡态结构和反应路径；预测反应位点、揭示反应选择性；模拟溶剂对反应的影响等。显然，理论计算是一门专业的学问，其结果需要与以上九部分所获实验数据相互验证。