内容摘要：

一、柱层析的适用范围

二、上样的注意事项

三、过柱子是有损失的

四、柱层析用什么填料？

五、装柱子、选柱子的注意事项有哪些？

六、柱子的技术指标

七、过柱注意事项

八、TLC展开剂对柱层析洗脱剂的指导作用

九、柱层析的洗脱剂选择

十、如何接液，如何浓缩？

正文部分：

一、柱层析的适用范围

其一，柱层析是化合物纯化的主要手段，但不是唯一手段！如果化合物溶解度很差，须尝试重结晶（母液中以杂质为主）；如果化合物分子量小、难显色或沸点低、易挥发，应蒸馏纯化（2-氧代丙酸叔丁酯、五甲基胍等）。

其二，即使溶解度好，也不是所有反应都需要过柱纯化。例如制备初始原料，反应规模在10-20 mmol，完全有可能粗处理直投下一步；羟醛缩合，体系内产物大量析出，搅都搅不动，重结晶只需十分钟就能得到纯的查耳酮；制备α-溴代烯酮，只需要抽滤去除碳酸钾，直接加三乙胺，1,2-二溴化物无需过柱纯化。

其三，柱层析不能解决一切纯化问题，有些点就是过不开，比如苯乙炔、TMS苯乙炔和碘苯之间，用石油醚爬板都到顶。天下还有比己烷/石油醚极性更小的溶剂？再比如，原则上讲所有非对映异构体都可以过开，但实操当中TLC就是一个spot，难道要收前三管、后三管分别打核磁看比例变化？有些阻旋异构体也是如此。

其四，柱层析的分离能力有限，有些柱子要过2-3遍，没必要有心理负担。例如两个点离得近上样量又大，体系内有易析出的副产物（三苯基氧膦/磺酰胺盐等）导致包夹吸留等；如果柱子一开始就过杂了或错选大极性洗脱剂，干脆全部冲下来，重新上样，再过一次。

二、上样的注意事项

其一，上样前必须淬灭，或必须最大限度地去除副产物。不要把纯化的重担一股脑全抛给柱层析。例如三乙基硅烷/TFA还原，后者作溶剂。如果用三乙胺淬灭，那么大量的有机盐会占用巨量的粗硅胶，上样层极厚，分离效果奇差；Corey-Chaykovsky反应，如果不加水萃取，直接拌硅胶旋/抽干体系中的溶剂水，那么相转移催化剂和氢氧化钠会使硅胶结块、粘连；20 mmol 的Sonogashira反应，体系内有大量三乙胺的氢碘酸盐，抽滤/EA洗涤后再上样，可省去很多麻烦。

其二，上样有干法上样和湿法上样两种方法。干法上样可以最大限度规避DCM等大极性溶剂对分离效果的影响，操作方便不易翻车，但需要装有低温冷阱的油泵，否则溶剂抽入油泵容易导致锈蚀。湿法上样对设备的要求简单，但需要学会严格控制上样所用溶剂量，一般少量DCM加适量PE，将物质转入柱顶。如将一次性胶头滴管减去胶头顶作为一勺，1 mmol 反应干法上样加入粗硅胶2.5-3勺，0.2 mmol 加1-1.5勺。如果干法上样所用硅胶太多，或湿法上样加入溶剂层太厚，会严重影响分离效果。

其三，有些时候，柱顶会粘连导致溶剂无法通过，例如Corey–Fuchs反应、Mitsunobu反应、淬灭不净的DMP氧化、长时间加热后的Sonogashira反应等。需要用长刮刀从溶剂球顶端插进去，搅开粘稠致密的柱子顶端硅胶。正常被溶剂浸润的硅胶，插进去只能感到轻微阻力。

三、过柱子是有损失的

与其他纯化手段一样，柱层析的损失不可避免，因为有些管子里有产物但太淡了TLC看不出来，有些管还有其他杂点就不收了。所以100mg的东西，实收98-99mg不奇怪。同一物质反复多次过柱，即使（在硅胶上）不会坏掉，也有可能越过越少。

四、柱层析用什么填料？

大多数情况用硅胶就足以应付。课题组不同，习惯不一样，一些组用细硅胶300-400目过柱子，有些组用200-300目过柱子。粗硅胶100-200目是用来干法上样的。注意，“目”是衡量硅胶比表面积的指标（定义为在长一英寸的筛网上的筛孔数目），目数越高，硅胶颗粒越小，柱子装紧后液体通过的阻力越大，理论上说分离效果就越好。除此外，还可以选用酸性、中性和碱性氧化铝作填料，但最常见的是100-200目的，装柱后液体流动过快；300-400目的不好买，买来后装柱子太紧密，溶剂很难流动。

五、装柱子、选柱子的注意事项有哪些？

基本的装柱技术这里就不教了，每个组有每个组的习惯。我提几点注意事项。

其一，建议使用带砂芯的柱子，除了洗起来略麻烦，其余全是优点。不带砂芯的柱子要先在抽气下用四氟搅拌棒压实棉花，再加入适量石英砂，再装填硅胶。无论带不带砂芯，柱顶都要装一层石英砂，既可以吸附湿法上样时的蜡状难溶物或固体，避免堵柱子，也可以避免添加洗脱剂时冲毁柱顶，将上样物溶于洗脱剂，分离失败。柱子过完，层析柱头朝下插进废液桶，打开下旋塞，洗耳球对接尖口并挤压，即可将硅胶柱挤出。万一棉球下不来，可用胶管接到水龙头上，用水冲掉。

其二，注意检查下方旋塞密闭性是否良好。如果拧紧状态下还在漏，别用，否则一部分产物冲下粘连的杂质，另一部分粘在旋塞造成损失。聚四氟乙烯旋塞有良好的润滑效果，不要自作聪明涂真空硅脂或凡士林，否则就是为产物引入高场鬼峰（grease, 聚二甲基硅氧烷，0.07 ppm in 氘仿）。

其三，柱子越粗，（个人认为）柱子的分离效果越好，但由于横向扩散严重，故容易把点过散，即管子里有但荧光弱看不出；柱子越细，能处置的反应规模就越小。例如最小的柱子（φ = 10mm）是用来处置100mg以下的化合物的。如果反应规模在5-10mmol，建议用φ = 30-40 mm的柱子。反应规模更大的，如果没有φ = 50 mm 的柱子，可以分批过柱。化合物＜ 50 mg的，建议爬大板。

其四，柱子装得越高，理论上分离效果越好（个人经验分离效果提升有限），但消耗溶剂越多，过柱时间更长。大多数情况下，硅胶柱装10-15 cm左右就够了。

其五，有时硅胶需要装短点，例如简单的反应体系（TLC只有一个产物点）、产物为大极性物质（酯的水解）、产物滞留过久会变坏（制备亚胺）等。同时，层析柱可以充当垫硅胶的抽滤漏斗（俗称“过短柱”），例如Mitsunobu反应需要先滤一次把三苯基氧膦除掉；多步制备时须滤去前序步骤中的不溶固体或大极性深色色带，随后直接投下一步；固液混合等复杂体系滤一下才能打粗核磁。

其六，出于种种原因，即使柱子在目视下已经装得无比端正、紧实，但过柱时也可能发现色带歪斜。这不算正常也不奇怪。大多数时候歪斜的色并不会影响过柱效果，除非两个点离得颇近。

其七，原则上说，柱子不能有气泡，更不能过干，否则气体涌入硅胶导致流动相受阻而流向混乱，影响分离效果。我装柱子都会装实，即使柱内溶剂告罄气体也仅进入硅胶上层，所以我不确定气泡对分离效果影响的程度。如果很介意气泡，可以用洗脱剂压实，或在不加压情况下拍打柱身，气泡可排尽。

其八，柱子不能过夜。原因：化合物浸在硅胶和洗脱剂中，可能变坏；如在夏天，溶剂挥发产生气泡，硅胶层开裂；长时间静置，化合物会上下扩散，导致已经分开的spot杂在一起。

六、柱子的技术指标

一般地，φ = 26mm，有效长203mm，节门孔径2mm，19/22的带砂芯柱可以应付绝大多数3 mmol 以下的反应的柱层析。多花点钱买联华的，用料足体型大；欣维尔和泰坦的娇小一些。

其中 φ 指外径；有效长即可以装硅胶的长度，不含上磨口和下阀；19/22前边的19指的是磨砂口径，后边的22指的是插入深度，有22/26两种，基本上可以互用。注意，实验室开反应的仪器绝大多数是19口，少数是更小的14口，24口恰好可以放进一个5ml的样品瓶，旋蒸的防溅球上端是29口，下端是19或14口。

七、过柱注意事项

其一，大多数时候徒手捏气囊为柱子加压，少数用气泵，极少数用氮气钢瓶。压力越大越危险。必须用塑料夹子或橡皮筋夹紧溶剂球和柱子避免洗脱剂飞溅洗脸。

其二，洗脱剂与TLC展开剂相似但不完全一样，溶剂的选择和比例要结合各位读者的研究体系，各自课题组的习惯和经验更有价值。

其三，不要自以为是地把你认为的产物点收起来，随手把柱子洗掉。当你不确定过出来的点是不是产物时，最好在过柱前为反应液留样（柱前点），这样随时可以通过TLC观察产物有没有出来，还可以看出产物在硅胶里坏没坏。如果没留样，用显著的大极性洗脱剂冲一波（比如10/1过的柱子用2/1冲)，收集起来，等到核磁确认你收的主点没问题再扔掉。

八、TLC展开剂对柱层析洗脱剂的指导作用

TLC展开剂对柱层析洗脱剂的选择有指导作用。但前提是用合适的展开剂把目标spot爬到合适的高度。一般地，TLC 10/1爬到1/3高的两个点，过柱子时至少从20/1开始将两者冲开。两个点用30/1爬到相似高度，想要分开至少选择100/1，甚至用乙醚替代EA作极性溶剂。5/1爬到相似高度，直接用5/1冲反而效果一般，可能要用3/1。

由于上样量不一样（TLC只有一个点而过柱子按原料算也有50-100mg），TLC（硅胶薄层）和柱层析（硅胶粉）的分离效果也不一样，如果发现TLC看到的spot过柱子过不出来，或过柱子得到的spot却在TLC上看不到，属于正常现象。严格说来，只要样品层足够薄，柱子又足够细，柱层析的分离效果就与TLC几乎一致。但大多数情况下TLC情况与过柱情况是一一对应的。如果意外发现显著的其它点，要考虑产物在硅胶上变坏了。

最倒霉的就是一些物质荧光弱，TLC时反应液浓度高看不出来，过柱子时拖尾每一管都很淡，如果只通过荧光判断、收管会导致大量损失，甚至高锰酸钾显色也可能不管用。这个时候建议改用DCM作大极性溶剂，利用DCM的优秀溶解能力把东西冲下来。我做过把四氢呋喃酯变为四氢呋喃醛，产物荧光就很弱，初期过柱损失大，后来用纯DCM过，再后来淬灭后干燥直接重结晶，产率95%。

九、柱层析的洗脱剂选择

其一，压柱子的30-40 mL石油醚可以随便回收，但上样后最先冲出的石油醚不一定能随便回收利用。对于Sonogashira反应来说，未反应完的苯乙炔、TMS乙炔及其自偶联产物会被石油醚冲下；还原双键时过剩的三乙基硅烷也是如此。最倒霉的是上述小极性物质，有时只用石油醚冲不干净，带点极性才能冲尽。

其二，洗脱剂的极性（从大到小）：乙酸＞水＞甲醇＞＞丙酮＞EA＞DCM＞甲苯＞石油醚/己烷≈环己烷。常用的洗脱剂是PE/EA组合，也有PE/DCM、PE/乙醚及DCM/甲醇组合。PE是唯一的小极性溶剂，有钱可以拿正己烷替代，但很少有人用环己烷；DCM溶解性强但极性不如EA，但正因为溶解能力好所以大极性物质可能被溶解并冲下；一般地，乙醚的分离度比EA更好；甲醇可能溶解硅胶，所以可以拿乙醇代替（以上系个人经验仅供参考，实操请参照个人反应体系特点适时调整）。

其三，洗脱剂的用量取决于分离难度。对于我的体系而言，0.2 mmol反应用PE/EA =150/15 mL 足够（再加上前序石油醚回收）；0.1 mmol 用100/10 mL。读者须根据自己反应体系的特点总结经验并灵活选择，宁少量多加，不能一次加多。不能出现点都要过完了，还一次加入200 mL溶剂的行为。

其四，洗脱剂的极性调配。除非两个点离得很近，需要小极性长时间冲以分开，否则洗脱剂极性要缓慢增加，节省溶剂用量。这一点不需要文献和师兄明示，自己就该想到。例如上方的sopt终于用50/1冲尽了，下边的spot改用20/1乃至10/1冲尽；30/1持续冲还不见东西下来，可以改用20/1冲一轮，而不是一直用30/1冲一个下午。我的最高纪录是一个下午过四根柱子；一根柱子过一个0.2 mmol的点，从上样到浓缩抽油泵，大约需要35-40分钟（旋蒸不排队的情况下）。

其五，不要盲从文献中的洗脱剂。SI决大部分内容是学生写的，有的应付老板随便写写与实际不符，有的直接copy往届工作改都不改；导师只看核磁是否准确，很少仔细检查洗脱剂的细节，错误就代代相传。有Heck偶联的文献毫无来由地用甲苯和甲醇过柱子，事实证明PE/EA完全可以；有的文献用DCM/甲醇过小极性物质；有的文献用己烷和异丙醇过柱子（显然把HPLC的极性抄过来了）。师兄师姐的实验记录本上的洗脱剂也不能盲从。有些顺手写错，有些靠回忆补足，有的反应规模不同，有些即使准确但你的水平（上样、冲淋）不如师姐，所以只能作为重要参考，自己亲自从适当低极性开始尝试。

其六，有些时候，即使是干法上样（完全抽干、适量硅胶），冲淋时也会受到大极性物质的干扰。比如，反应淬灭后直接上样，两个点用PE/乙醚/DCM = 50/1/1 勉强分开（约1/2部分重叠），但滤除柱顶色带、柱前物后重新上样，用PE/乙醚/DCM = 40/1/2 能在中期出点、完全分离。

十、如何接液，如何浓缩？

其一，实验室常见φ = 15 mm，长100 mm 的小试管，也有φ = 15 mm，长150 mm 的大试管。接液时，液面距离管口约一公分（目视估计）。个人过柱时主要用前者。一个250 mL 茄形瓶，算上洗涤用的DCM，最多可以放10支小试管，但建议放8支；500 mL茄形瓶，算上洗涤用DCM，最多可以放20支小试管，建议放15-17支。这里的“最多”指的是旋蒸时倾斜的液面已接近磨口，初期一旦沸腾起泡易冲料。

注：试管架建议选15.5 mm×40孔，但常见的是18/20 mm的，有的甚至只有30孔。接好液的试管排序可选Z型、S型和交错型，看个人或课题组的习惯。一般地，试管架在操作者（人）的右前方。

其二，一些时候，固体会在过柱时析出。如果在试管里析出，不用管；如果在柱下端斜口析出，DCM冲一下；如果在旋塞及附近析出，可能堵塞液流，需要用毛细管向上捅一下（操作难度大，可能会损失产物）；如果在硅胶上析出，最好方法是过柱时适当添加DCM（PE/EA = 10/1改为PE/EA/DCM = 10/1/1）作为预防，否则使用纯DCM冲收回产物，再尝试重结晶（此时杂质被硅胶吸附，纯度达到重结晶要求）。

其三，有些时候液体冲下来会发热，这是物质、溶剂与硅胶的吸附热与摩擦热，正常；有时候液体冲下来会浑浊，特别是大极性冲洗时的第1-2管，这是硅胶中吸附的水被冲下。

其四，并不是所有时候都必须用试管接收样品。制备反应规模大或只有一个点，可以直接拿25/50 mL小锥形瓶接。

其五，大瓶子旋完，用适量良溶剂转移到小瓶后，可进行TLC检测，看有没有把一些淡杂点一起过下来，或产物有没有在受热（旋蒸水浴）和氧气下变坏（特别是胺等敏感物质）。